近日，華中農(nóng)大棉花研究團隊有關(guān) CRISPR/Cas9 技術(shù)在異源四倍體棉花中的應(yīng)用獲得重要進展，相關(guān)成果在線發(fā)表于植物學主流學術(shù)期刊 Plant Biotechnology Journal，題目為【High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system】。依賴于團隊高效的遺傳轉(zhuǎn)化平臺，該研究拓展了 CRISPR 技術(shù)在多倍體作物中的應(yīng)用，為棉花功能基因解析提供重要的技術(shù)手段。論文共同第一作者為博士生王鵬程和碩士生張軍，張獻龍教授和金雙俠教授為論文的共同通訊作者。
自 2013 年在真核生物中成功應(yīng)用以后，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)成為生命科學研究的關(guān)注熱點，成為近年來最受歡迎的基因組編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有穩(wěn)定性強、效率高和操作簡單的特點。利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)能夠成功實現(xiàn)基因組水平的基因敲除，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和修飾。目前該技術(shù)廣泛應(yīng)用于動物細胞，植物中在水稻、擬南芥、玉米等模式作物中應(yīng)用較多，而在多倍體植物，如棉花，油菜中的應(yīng)用較少。原因在于目前生產(chǎn)上種植的棉花是異源四倍體，有 52 條染色體，基因組龐大、復雜（2.5 Gb，相當于擬南芥基因組大小的 20 倍，水稻基因組的 6 倍），同源重復序列多（70% 左右），同一基因也具有多個拷貝，目前很難獲得有效的單基因突變體。目前在棉花中常規(guī)的基因功能研究手段是 RNAi 技術(shù)，該技術(shù)往往造成同源基因（基因家族）的沉默表達而產(chǎn)生非預期的表型，同時 RNAi 技術(shù)往往對靶標基因沉默不徹底，后代中也出現(xiàn)沉默效應(yīng)不穩(wěn)定，甚至消失的情況，因此在棉花中開發(fā)新型的功能基因組研究手段，勢在必行。
圖片說明：CRISPR-Cas9 系統(tǒng)成功敲除棉花基因組中的外源 dsRFP 基因
華中農(nóng)大棉花團隊至從 2013 年開始，就在棉花中開始了基因編輯的研究工作，包括構(gòu)建了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的 TALEN 載體及三套 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)。在本研究使用的載體是本實驗室運用的第三套 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，該系統(tǒng)針對水稻中已有的 CRISPR/Cas9 表達載體進行了改造，使用了棉花內(nèi)源的 U6 啟動子和合適的抗生素篩選標記。利用一個已經(jīng)獲得外源報告基因 DsRed2（紅色熒光蛋白基因）的材料為受體進行二次轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)了兩個靶標位點的同時敲除，再生植株的紅色熒光完全消失。另外，以內(nèi)源的棉花葉綠素合成相關(guān)基因 GhCLA1 為靶標設(shè)計的三對 sgRNA 也成功實現(xiàn)基因敲除，各靶標位點的編輯效率達到 66.7%~100%，再生植株產(chǎn)生顯著的白化苗表型。對 T0 代植株及其后代的的遺傳分析表明，目標基因可以被突變但沒有脫靶效應(yīng)，而且這種突變能夠穩(wěn)定遺傳到后代。本研究創(chuàng)新之處在于充分結(jié)合第二代高通量測序技術(shù)，實現(xiàn)對大量再生植株突變位點的快速鑒定，大大提高轉(zhuǎn)基因植株突變鑒定的效率，為實現(xiàn) CRISPR/Cas9 系統(tǒng)創(chuàng)造棉花基因突變體庫及功能基因組研究打下堅實基礎(chǔ)。目前這一高效的棉花基因編輯載體已經(jīng)通過合作研究的形式發(fā)放給包括澳大利亞聯(lián)邦科學與工業(yè)研究組織（CSIRO）、浙江大學、南京農(nóng)大、華中科大、華中師范大學、西南農(nóng)大、山東農(nóng)大、石河子大學、中棉所等國內(nèi)外 10 多家國內(nèi)外科研機構(gòu)的同行，共同推動棉花的基因組編輯工作。
本研究獲得十三五國家重點研發(fā)專項和轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ椈鸬拇罅χС帧?/span>
原文檢索：
High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system